上一张 下一张
  • 1
  • 2
  • 3
  • 4
当前位置>主页 > 技术服务 > 技术服务 > 口蹄疫疫苗抗原含量检测方法
口蹄疫疫苗抗原含量检测方法

       口蹄疫(Foot-and-Mouth disease virus,FMDV)是由口蹄疫病毒引起的一种急性、热性、高度接触传

染性的动物疫病,对畜牧业有着巨大的危害。目前大多数国家采取计划免疫为主的措施预防和控制口蹄疫,

口蹄疫疫苗的质量是保证控制措施实施的重点,而抗原含量直接决定口蹄疫疫苗的质量和免疫效力。

       口蹄疫疫苗的生产需要按照GMP要求对工艺流程实行全程监控,包括病毒液收获、病毒液过滤、灭活、

浓缩之后活病毒或灭活病毒含量的监测,对于口蹄疫抗原含量的检测分为生产过程中的检测及成品疫苗中抗

原量的监督控制。鉴于我国目前的特殊情况,急需建立一种检测口蹄疫病毒灭活疫苗中病毒抗原含量的实验

室检测方法,配合其它方法以提高口蹄疫疫苗质量监管力度,确保我国重大动物疫病强制性免疫防控措施的贯彻

执行。


1.ELISA方法
 
     用纯化好的FMDV灭活抗原对Balb/c系小鼠进行三次免疫,首免采用颈背部皮下多点注射,使用弗氏完全

佐剂乳化抗原;两周后采用腹腔注射进行第二次免疫,使用弗氏不完全佐剂乳化抗原;两周后采用尾静脉注

射再进行加强免疫;3天后进行融合。采用经典的融合方法进行杂交瘤细胞的融合与筛选操作,使用间接夹心

ELISA方法对分泌抗口蹄疫146S抗原单克隆抗体的杂交瘤细胞进行检测。采用有限稀释法对筛选出来的阳性

杂交瘤细胞进行克隆化,并进行扩大培养及大量冻存,使用腹水法大量生产单抗。使用间接ELISA法测定腹水

型单克隆抗体及细胞培养上清液的效价,对各株单抗的腹水样品进行免疫琼脂扩散试验来确定单抗的类型。

通过West-blotting试验确定抗体构型。确定抗原含量与抗体滴度之间的线性关系。

 
      简单来说该方法就是制备口蹄疫病毒单克隆抗体,建立血清学方法测定疫苗中总抗原含量。该方法优点是

成本低,利于推广使用,可以批量进行样品抗原含量的比较,操作简单快速,结果特异,缺点是单克隆抗体

制备过程复杂,且只能检测部分抗原位点,若抗原位点组成有变化,使用该检测方法可能有误差。


2.蔗糖密度梯度法
 
       在口蹄疫疫苗的生产过程中,146S病毒粒子作为口蹄疫病毒的主要免疫原,其任何形式的降解都会导致

疫苗免疫效力的下降。传统的监测方法中首先通过补体结合试验估测总抗原含量(包括146S和12S),然后用氟

化碳处理除去12S抗原,间接估测出主要免疫原146S的CF量;或者超速离心获得146S抗原,直接估测146S的

CF量。一些生产厂家通过蔗糖密度梯度离心法获得一定体积口蹄疫病毒146S病毒粒子,使用紫外分光光度计在

259nm紫外光下检测吸收峰,从而测定其含量。采用这种方法可以快速测定出在紫外分光光度计图表中病毒

峰区域的146S病毒粒子含量,并且可以用于生产过程中病毒和抗原收获量的监测,也可用于成品苗中口蹄疫

病毒146S抗原含量的测定。测定口蹄疫病毒146S抗原量也可通过氯化铯密度梯度离心法进行定量分析,在

ug/ml水平估测146S抗原量,并用PAGE凝胶电泳检测口蹄疫病毒抗原多肽的完整性,并确定其质量。


3.组织细胞培养法
 
       组织细胞培养法主要使用实验重复性较好的BHK21传代细胞系来进行,通过在显微镜下观察不同稀释度

的 FMD病毒感染 BHK21细胞时所产生的 CPE来判定实验结果,该实验耗时较长,人为因素影响较大。


4.病毒蚀斑数测定法
 
       目前,国外一些实验室和疫苗公司采用病毒蚀斑数测定法。使用BHK21细胞或IB-RS-2细胞,按常规方法

来培养细胞,用无菌 PBS冲洗细胞,病毒作梯度稀释,接种细胞培养板,在CO2培养箱里培养 1小时后,加入

一定量的培养液,静置培养48小时,弃去培养液,加固定液固定,染色30分钟,蒸馏水冲洗,自然干燥后进

行判定。FMD病毒感染细胞时,先感染离它最近的细胞,最终形成了一个个肉眼可见的病毒感染斑,对感染

斑记数,按特定的公式来计算病毒的滴度。该法操作方便,判定方法简单快捷,测定结果也很准确,值得借

鉴。缺点是没有涉及到抗原性的变化。


5.乳鼠接毒法
 
       病毒梯度稀释后接种乳鼠,一定日期内统计小鼠死亡数量,计算病毒的LD50。该方法缺点是用时较长,

通常为3~4天,不利于疫苗生产企业的集约高效生产。另外,动物水平的实验由于样本数量的限制,误差较

大。


6.荧光定量PCR
 
       实时荧光定量RT-PCR(Realtime Fluorescent Quantitative PCR)技术是通过荧光染料或荧光标记的特异性探

针,对PCR产物进行标记跟踪,实时在线监控反应过程,结合相应的软件可以对产物进行分析,计算待测样品

模板的初始浓度。该技术以特异性强、速度快、灵敏度高等优点,在基因表达水平分析、病原体基因的定性

和定量检测等方面得到广泛应用,并且已经成为当前病毒核酸快速检测的主要方法。利用口蹄疫146S抗原定

量技术抗原含量关系的标准抗原作为对照,通过对口蹄疫病毒的RNA进行检测,并进行待检样品与标准抗原曲

线的对比,实现由病毒RNA荧光Ct值的测定向抗原含量的转变(Ct值指每个反应管内的荧光信号到达设定的域

值时所经历的循环数,每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数呈线性关系)。该方法操作用时短,节

约生产成本。缺点是检测过程可能出现反应的不稳定性,造成误差。

7.蛋白层析法
 
       胶体金免疫层析技术(GICA)是20世纪80年代在胶体金标记技术、免疫层析技术基础上建立的一种独特

的免疫学检测技术。它以胶体金作为示踪物,利用特异性抗原抗体结合原理,通过胶体金颗粒的颜色放大免

疫反应系统,使反应结果在固相载体上直接显示出来。

 
       FMDV感染动物后可造成隐性感染,并在易感动物之间进行传播。制定区分感染动物与免疫动物的有效检

疫是控制其流行的根本措施。FMDV的一种 NSP抗原(VIAA,3D)仅与感染动物的血清产生反应,随着对FMDV

NSP研究的进一步深入,研究者认为针对非结构蛋白3ABC抗体的检测是一种理想的检测方法。在这些研究的

基础上,可利用大肠杆菌高效表达的FMDV 3ABC多肽作为包被抗原,建立可区分感染动物与免疫动物的试纸

条技术。

 
       胶体金试纸条具有操作简单,检测速度快等优点,但是该方法的 结果判定是通过观察检测显色条带的有

无,因此大多数胶体金免疫 层析试纸条只能用于定性和半定量的检测。

8.分子排组色谱法
 
       2011年Marcelo等建立了一种新的方法来定量口蹄疫病毒完整粒子。是在疫苗生产过程中通过分子排阻色

谱来分离病毒培养液中的不同组分,将146S分离出来,通过波长254nm下的光吸收值来测定146S含量。检测

范围为 5~70ug/mL,该方法适用于不同的口蹄疫病毒株,与蔗糖密度梯度离心法有良好的相关性。这种方

法使用标准的层析介质,可以实现自动化操作。这种方法如果能开发成一种成熟的检测试剂盒,极有可能成

为口蹄疫疫苗生产过程中的一种新检测工艺,用于监控最终产品的质量。但与其他方法相比,该方法最低检

测限高,灵敏度低,不适宜用于146S含量较少的样品,不能区分检测到的146S是否被蛋白酶水解。该方法自

动化程度高,操作相对简单,但检测灵敏度目前不高,有待进一步的提高。


9.其他
 
       用于抗原定量的其它方法有放射免疫试验、反向被动血凝试验及固相红细胞凝集试验。这些试验的敏感

性也较高,特别是反向被动血凝试验和夹心ELSIA 具有同样的敏感性。用这些方法所进行抗原定量和疫苗的免

疫保护的关系尚需进一步研究。